郑裕国院士团队郑仁朝教授课题组发表论文：纳米限域多酶级联策略高效合成D-阿洛酮糖

近日，浙工大生工学院郑裕国院士团队郑仁朝教授课题组在《Chemical Engineering Journal》期刊发表题为《Nanoconfined enzymatic cascade strategy for highly efficient synthesis of D-allulose》的研究性论文，本研究提出了一种纳米限域多酶级联催化策略，用于高效、可持续合成D-阿洛酮糖(D-alluose)。该研究通过将五种关键酶(α-葡聚糖磷酸化酶、磷酸葡萄糖变位酶、磷酸葡萄糖异构酶、D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶和D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶)共封装于β-环糊精-b-聚乙二醇-b-聚苯乙烯嵌段共聚物构建的纳米反应器中，实现了以麦芽糊精到D-阿洛酮糖的高效从头合成。课题组青年教师詹侃为第一作者，郑仁朝教授为通讯作者。

图1 纳米限域多酶级联策略一锅法高效合成D-阿洛酮糖

为实现多酶级联反应的高效协同催化，本研究设计并构建了基于β-环糊精-b-聚乙二醇-b-聚苯乙烯嵌段共聚物的纳米反应器。通过核磁共振氢谱（¹H NMR）、透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、氮气吸附-脱附及共聚焦显微镜等多种表征手段，证实模式酶D-阿洛酮糖-6-磷酸差向异构酶与D-阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶被成功限域固定于载体内部。该策略为构建高效、稳定、可循环的多酶纳米催化系统提供新思路。

图2 纳米限域多酶级联策略的设计与表征

为实现纳米限域多酶级联体系的高效固定化，本研究系统优化了氨基化时间、交联剂浓度、固定化温度与时间四个关键参数（图3）。实验表明，3 h氨基修饰可实现最优氨基密度，此时酶活性回收率与固定化效率分别达到54.6%和76.5%。进一步采用响应面法（RSM）解析多参数间的交互作用，最终确立最优固定化条件为：温度15°C、时间6 h、载体添加量174 mg/mL、酶浓度0.26 mg/mL。在此条件下，酶活性回收率提升至80.6%，固定化效率达92.1%，为构建高性能生物酶级联纳米反应器提供了可靠的实验基础。

图3 固定化最佳条件研究

在完成固定化条件优化后，本研究系统评估了纳米限域多酶级联体系的催化性能与稳定性（图4）。结果表明，该体系在pH 6.0和50 °C条件下表现出最佳催化活性，并展现出显著增强的热稳定性与溶剂耐受性。在60 °C下处理10 h后，其相对活性仍保留约51%，远高于游离酶体系。50 °C下的半衰期延长至27.9 h，较游离酶（15.5 h）有显著提升。在重复使用8次后仍可维持约60%的初始活性，贮存40天后活性保留率超过75%，显示出良好的操作与长期稳定性。在果糖-6-磷酸至D-阿洛酮糖的转化反应中，该体系实现了93.1%的转化率，进一步验证了其高效的生物催化潜力。

图4 纳米限域多酶级联策略的酶学性质

该策略通过在纳米限域结构中共固定五种关键酶，突破了传统依赖D-阿洛酮糖3-差向异构酶的单酶转化模式。实验结果表明，该体系在50 °C条件下，不添加任何辅酶的条件下反应36 h，D-阿洛酮糖收率达77.3%（42.9 mM），底物转化率为80.5%，性能显著优于游离酶体系（44.5%，24.8 mM）。HPLC分析进一步证实，纳米限域策略几乎无副产物生成，表明限域效应可有效提高底物局部浓度并促进中间产物通道传输，从而显著增强级联反应效率。

图5 纳米限域多酶级联策略用于一锅法从头合成D-阿洛酮糖

为评估纳米限域多酶级联策略的工业化潜力，本研究系统考察了不同底物浓度（5–50 g/L）下麦芽糊精一锅法转化性能（图6）。在50 g/L高底物浓度条件下，不添加任何辅酶条件下，该策略于50 h内实现D-阿洛酮糖产量145.7 mM（收率52.1%），显著优于文献报道水平（约90.0 mM，收率33.0%）。通过HPLC过程监测结果显示，即使在高底物浓度下，体系仍保持优异的选择性，副产物水平极低（图6）。研究表明，该纳米限域多酶级联策略可作为模块化催化平台，有效协调多酶协同催化过程，兼具高转化率、低副产物生成及良好规模化适应性，为高值稀有糖的工业生物制造提供了具有应用前景的技术路径。

图6 麦芽糊精为初始原料，通过纳米限域多酶级联策略一锅法合成D-阿洛酮糖的潜在工业化应用