近日，学院柳志强教授等在Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊发表题为《Integrated Protein Engineering and Expression Balancing Enable Efficient d-Allulose Production》的研究性论文，通过半理性设计对解纤维梭菌来源DAE进行改造，获得热稳定性显著提高的三突变体F155Y/D281G/C289R，熔解温度提高12.0℃至73.2℃，70℃下半衰期延长17.6倍，转化率提升至33.3%，综合性能优于已报道水平；进一步构建模块化共表达系统，平衡该优化酶与嗜热葡萄糖异构酶的表达水平，实现一锅法级联高效反应。课题组蔡雪副教授为第一作者，柳志强教授为通讯作者。
图1 工程化大肠杆菌生物合成D-阿洛酮糖的技术路线图
D-阿洛酮糖作为一种具有广阔应用前景的稀有糖，可通过D-葡萄糖异构酶（GI）、D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DAE）进行生物催化合成。然而，酶的热稳定性与级联反应效率的不足限制了其在低成本底物中的工业化应用。
1. 高活性DAE的筛选
研究首先通过系统发育分析从NCBI中筛选出六种DAE，在大肠杆菌中成功表达后，酶活测试表明，源自解纤维梭菌的CcDAE和根癌农杆菌的AtDAE表现出最高的催化效率，在50 g/L果糖和F42果葡糖浆中均保持27.5%的转化率，优于AgDAE（23.1%）和PcDAE（17.8%），且CcDAE达到反应平衡的速度最快，仅需0.5小时。
图2 六种DAE酶的实验表征
图3 CcDAE和AtDAE的酶特性比较
2. CcDAE定点诱变提高热稳定性
为进一步提升其工业适用性，研究通过序列比对、底物结合口袋分析和C端修饰三种策略，对CcDAE进行定点突变。研究首先通过序列比对筛选保守位点，发现突变体F155Y和V253I活性分别比野生型提高了2.3倍和1.2倍；其次，靶向底物结合口袋，发现Q277R突变体能将活性提升2.5倍；最后，聚焦于稳定带负电的C末端，发现D281G和C289R突变体活性分别为野生型的9.6倍和12.5倍。
图4 CcDAE的结构分析和定点诱变
3. CcDAE突变体的结构分析和组合诱变
在阐明单点突变机制的基础上，研究进一步构建了双突变体和三突变体。结果显示，组合突变展现出显著的协同效应，双突变体（如F155Y/D281G）在70℃下的半衰期提升至207.6分钟，而三突变体F155Y/D281G/C289R更是将半衰期提升至255.4分钟，是野生型的17.6倍。
图5 野生型CcDAE及其有益突变体的热稳定性分析
4. 三位点突变体F155Y/D281G/C289R的表征
研究对获得的三突变体进行了全面的酶学性质表征。结果显示其最适温度为60℃，最适pH为7.0，且仍依赖Co2+作为辅因子。热稳定性方面，其熔解温度（Tm）达到73.2℃，比野生型提高了12.0℃。动力学参数分析表明，三突变体对底物D-果糖的亲和力更高（Km值从28.5 mM降至22.3 mM），催化效率（Kcat/Km）近乎翻倍。在300 g/L的高浓度D-果糖底物下进行转化实验，三突变体最终将转化率从野生型的27.5%提高至33.3%，并且产量达到100 g/L D-阿洛酮糖。70℃下半衰期达4.3小时（255.4分钟）。
图6 三突变体CcDAE-F155Y/D281G/C289R的表征
5. CcDAE与TtGI在大肠杆菌中的共表达优化
为实现从葡萄糖一锅法合成D-阿洛酮糖，研究将CcDAE三突变体与TtGI构建在四种不同的双质粒共表达系统。最终研究将最优构建体（pRSF-DAE-GI）在三种不同底物（纯葡萄糖、F42果葡糖浆、玉米芯水解液）中测试了其一锅法转化能力。结果表明，在等效于100 g/L葡萄糖的底物浓度下，D-阿洛酮糖的产率分别为18.5%、17.4%和7.5%。即使在500 g/L的高葡萄糖浓度下，转化率仍能保持在18.3%以上，最终产量达91.3 g/L，展现了良好的工业应用潜力。
图7 GI和DAE的共表达及三种不同底物中生产D-阿洛酮糖
原文链接：https://doi-org.focus.lib.kth.se/10.1021/acs.jafc.5c09894