近日，学院程峰、薛亚平教授等在《Chemical Engineering Journal》期刊发表题为《Protein engineering and flow reactor design for anchored peptide-mediated continuous biocatalysis》的研究性论文，该研究基于锚定肽Cg63的连续流固定化酶体系，适用于六大类酶，结合分子模拟与定向进化优化，实现高稳定性与高产率，为工业生物催化提供可扩展平台。课题组博士生李欢为第一作者，程峰教授为通讯作者。
图1 用于材料特异性结合的锚定肽（AP）的系统筛选和评估
合成高分子材料因其稳定性与适用性，已成为酶固定化的重要载体。本研究从NCBI数据库筛选出7种全新锚定肽（Cg-Def-1、Cg-Def-2、LCI-1、LCI-2、TBP-1、TBP-2和Spingerin），并系统评估了它们在六类常见聚合物（PMMA、PVC、PET、PS、PP、PE）上的结合亲和力。研究采用荧光融合蛋白方法，实现了锚定肽与材料表面相互作用的半定量分析。结果发现，CgDef-2 在PMMA、PP和PS上展现最强结合力，表现出高度的多功能性；而其他肽则在不同材料中展现出优势，如CgDef-1适合PP，LCI-2对PS结合最佳。这一结果为构建高效的酶固定化平台提供了新策略和新思路(图1)。
主要研究内容：
1.锚定肽-PMMA相互作用的结合模式及接触残基分析
利用分子动力学模拟解析了锚定肽Cg63与PMMA的结合机制，发现其主要依赖氢键与静电相互作用，并呈现POSE I 与POSE II两种构象，其中POSE I 更为稳定。基于结构分析，研究确定关键结合位点并设计了定点突变。实验结果显示，E8N突变体的结合效率相比野生型提升36.5%，且在多种聚合物材料上均表现出增强的结合能力。模拟验证进一步证明其结合稳定性与设计预期一致。不仅揭示了锚定肽与材料表面的作用机制，还提出了结构导向的理性优化策略，为开发广谱、高效的酶固定化平台提供了新思路(图2、图3)。
图2. EGFP锚定肽（野生型）与PMMA表面相互作用的分子动力学（MD）模拟分析
图3. EGFP-Cg63融合肽与PMMA的分子相互作用和突变分析
通过分子模拟深入解析了E8N突变体在蛋白–PMMA界面的作用机制。结果显示，该突变体形成了更多接触残基，整体结合距离由野生型的1.14nm缩短至0.77nm，显著提升了与材料表面的接触紧密度。同时，其溶剂可及表面积减少1.4nm²，结合自由能较野生型降低约24.1%，进一步确认了结合亲和力的增强。实验与模拟均表明，E8N突变体在结合效率上提高了36.5%，充分验证了结构导向定向进化策略的有效性。本研究不仅揭示了锚定肽优化的分子机制，还提供了可靠的计算指标（MMPBSA与SASA）《为未来基于虚拟筛选与高通量平台的锚定肽设计奠定了坚实基础。
图4. 野生型和E8N（E267N）突变体锚定肽-PMMA界面相互作用分析
2.N-Cg63E8N-融合酶在PMMA微球上的固定化和催化性能分析
将锚定肽“N-Cg63E8N ”融合至多种功能酶，并固定在PMMA微球表面，实现了六大类酶（EC1–EC6）的高效催化。结果表明，固定化酶在转化效率上表现优异，如在摇瓶条件下固定化0.6 mg转氨酶ω-TA处理5mL底物浓度为2g/L的瑞美吉泮前体酮4小时后，转化率达到82.94%。实验结果显示，酶与锚定肽偶联后活性略有降低，但游离酶在连续循环了1–2批次后无催化能力，而固定化酶均可稳定运行10个循环，展现出显著的操作稳定性与可重复利用性(图5)。
图5. Enzyme-Cg63E8N的表征及其生物催化性能
3.基于酶尺寸和传质的微反应器设计
为突破PMMA微球固定化酶在循环反应中逐渐失活的瓶颈，本研究提出了创新的连续流生物催化系统。该系统利用PVDF外壳与PMMA毛细管构建微反应器，总内表面积超过5000cm²，可高效固定酶分子。设计时充分考虑了酶的三维结构尺寸和传质特性，确保微通道直径远大于酶分子尺度，避免空间位阻并提升底物混合效率。流体动力学计算显示Re=0.17-0.61，在90℃水相及50℃ DMSO 等实际条件下，反应体系处于层流扩散主导区间，不仅降低了剪切损伤，还保证了底物充分接触。该研究为酶催化过程的高效稳定与规模化放大提供了新路径，展示了连续流平台在绿色生物制造中的应用前景。(图6)
图6. 锚定肽介导的酶微反应器结构示意图
4.锚定肽介导的酶（EC1至EC6）固定化用于连续流生物催化
传统PMMA微球固定化酶在循环使用中常因机械碰撞而脱附失活。为此，研究团队创新性构建了基于PMMA通道的连续流微反应器，并引入优化设计的Cg63E8N锚定肽，实现酶的定向稳定固定。实验表明，该平台在连续流条件下对六大类酶（EC1–EC6）均具备优异表现：不仅保持高转化率（如在连续流反应条件下，CeDAAO对250mL、50mM D-PPT进行2小时连续进料（30 ℃）后，生成产物PPO的转化率达到90.3%，还展现出良好的循环稳定性，即使10次循环后仍能保留62–80%初始活性，其中StGshF最佳，保持80.3%。相比传统微球方法，该体系显著提升了催化效率与耐久性，为连续流生物催化的稳定运行与产业化应用提供了有力支持，展现出绿色制造与高效生物工艺的新前景。(图7、图8)
图7. 流动反应器中固定化(EC1-EC3)-Cg63E8N的催化性能
图8. 流动反应器中固定化(EC4-EC6)-Cg63E8N的催化性能
该研究得到了国家重点研发计划项目(22222811)、浙江省自然科学基金(LDQ24B060001)和国家重点研发计划(2024YFA0920700)资助。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894725088357