近日，学院柳志强教授等在《Chemical Engineering Journal》期刊发表题为《Sustainable antibiotic-free high-yield 1,4-butanediol production by engineered aldehyde dehydrogenase and carbon flux remodeling in Escherichia coli》的研究性论文，通过代谢工程对大肠杆菌的1,4-丁二醇(1,4-Butanediol，BDO)合成途径进行了系统改造，将BDO发酵产量提升至34.63 g/L。课题组博士生余涛为第一作者，柳志强教授为通讯作者。
图1 BDO的代谢途径及提高BDO产量的策略
BDO是一种非常重要的基础有机化学品，是生产聚对苯二甲酸丁二醇酯PBT、聚氨酯、THF等溶剂与弹性体的核心原料，产能达300万吨，广泛应用于化工等领域。传统BDO主要通过炔醛法或顺酐加氢化学法生产，依赖化石原料，对环境不友好。本研究系统优化了大肠杆菌底盘，整合多拷贝BDO合成基因、敲除副产物通路、工程化醛脱氢酶、调控TCA循环通量、引入非氧化糖酵解及乙酰辅酶A通路，同时提升胞内ATP水平。通过使用hok/sok系统引入，在无需抗生素和诱导剂条件下实现微需氧高效发酵，以葡萄糖为碳源获得34.63 g/L的BDO产量，展示了BDO绿色可持续生物制造的潜力(图1)。主要研究内容：
初始底盘菌株的构建和BDO合成途径酶的筛选及其多拷贝整合
作者首先将途径基因导入野生型菌株后，底盘细胞成功产出0.1 g/L的BDO，但有乳酸等副产物积累，继而敲除ldhA等副产物基因的同时对不同来源的酶的活性进行筛选，最终确定源自牙龈卟啉单胞菌的Pg_sucD、Pg_cat2，克氏梭菌的Ck_4hbD，以及拜氏梭菌的Cb_ald以及大肠杆菌内源醇脱氢酶Ec_yqhD为最优酶组合。携带该组合基因的菌株，其摇瓶内滴度达到0.82 g/L。(图2)
图2. 筛选BDO生物合成途径相关酶以实现高效BDO生产
BDO生物合成中碳代谢的调控
在发酵过程中，作者发现出现丙酮酸(BDO的合成前体)的大量积累，转化效率低导致碳损失。因此，作者替换NADH敏感的LpdA为LpdA*突变体和敲除转录抑制因子pdhR基因，提高丙酮酸脱氢酶复合物(PDHc)活性，增强丙酮酸向乙酰辅酶A转化，显著降低了丙酮酸积累量。为了增强TCA循环的氧化代谢通量，研究人员采用GltA变体R164L的应用(变体能够减少NADH对GltA的抑制)，敲除mdh和arcA基因进一步增强氧化TCA循环的活性，BDO产量达1.83 g/L。此外，作者通过减少乙酸积累，敲除ptsG、引入glf基因及过表达ppc基因，进一步优化了PEP利用率，BDO产量达2.13 g/L。最终，通过敲除sdhAB基因抑制琥珀酸消耗，成功将BDO的产量提高至2.45 g/L。(图3-4)
图3. 提高大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶复合物(PDHc)活性
图4. 平衡TCA循环碳通量分布、优化PEP利用对BDO产量的影响
改造醛脱氢酶提升BDO产量
作者还针对BDO合成中的关键醛脱氢酶Ald做了突变筛选，获得最优突变体Ald(M227V)，该突变体通过扩大酶的疏水活性口袋增强了对底物的亲和力，应用Ald(M227V)将 BDO产量增至4.71 g/L，4HB和乙酸分别降至1.55 g/L和0.93 g/L，副产物γ-氨基丁酸消失。(图5)
图5. 醛脱氢酶Ald改造提升BDO产量
增加BDO生产前体供应和改善辅因子的利用性
为优化碳通量，研究人员将大肠杆菌中依赖琥珀酰辅酶A的甲硫氨酸和赖氨酸合成途径替换为枯草芽孢杆菌的乙酰辅酶A合成途径，通过引入双功能磷酸酮醇酶(fxpK)，将葡萄糖高效转化为乙酰辅酶A，BDO产量达到5.29 g/L。通过敲除tesB和yciA基因，作者成功减少了乙酸和4HB的积累，BDO产量提高至5.67 g/L。进一步敲除二羧酸转运蛋白基因dcuB和dcuC后，BDO产量进一步提升至7.31 g/L，4HB降至0.30 g/L。由于NOG途径不产生ATP和NAD(P)H通过敲除amn基因，提高了细胞内ATP水平，使BDO产量增加至7.59 g/L，同时细胞生物量略有提升。(图6)
图6. 引入乙酰辅酶A途径增加前体及ATP供应提升BDO产量
利用hok/sok系统和天然调控元件构建BDO自我调控生产体系
为实现自调控BDO生产，作者引入大肠杆菌内源ldhA、adhE、ackA和frdABCD基因上游转录和翻译调控元件驱动BDO合成途径中异源基因的表达。结果表明，利用TREadhE调控的菌株在微氧条件下BDO产量达到7.88 g/L且优于对照。将hok/sok系统插入kan基因终止子下游，质粒丢失率最低仅5.5%，BDO产量最稳定。在无抗生素条件下，经过15次传代后，质粒保留率仍超过95%，摇瓶BDO产量稳定在7.5–7.8 g/L。(图7)
图7. 引入hok/sok系统实现无抗生素发酵产量
5L发酵罐中两阶段DO控制
在发酵初期，作者通过高通气和高搅拌速率将DO水平维持在20%，以支持菌株的快速生长。当菌株进入稳定期后，DO水平分别调整为10%和5%，同时将通气速率降低至0.5 L/min，将发酵条件从有氧转为微氧。这一策略将更多的碳通量导向BDO合成途径，而非细胞生长途径。实验结果表明，当DO水平维持在10%时，经过72小时发酵，BDO浓度达到19.68 g/L。然而，当DO水平进一步降低至5%，BDO产量大幅增加至34.63 g/L，同时，葡萄糖转化率提升至0.35 g/g，生产率达到0.48 g/h。(图8)
图8. 5L发酵罐中10%和5%溶氧条件下的发酵结果
该研究得到了国家重点研发计划项目(2022YFA0911800)、浙江省“尖兵”科技计划项目(2024C03012)和2023年浙江省博士后科研项目择优资助(ZJ2023159)。
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385894725073802