维生素B5（VB5），又称泛酸，是一种水溶性维生素，广泛用于医药、食品和动物饲料中。作为辅酶A（CoA）和酰基载体蛋白（ACP）的前体，VB5在脂质代谢、能量产生和细胞生物合成中起着关键作用。传统的工业VB5的生产主要依赖于化学合成（第一代生产技术），这依赖于石油衍生的原料，并产生氰化物等有害废物，引发了环境和可持续性问题。第二代生产技术采用化学酶法合成，但它仍然依赖于化学合成底物D-泛解酸和β-丙氨酸，其并未根本解决第一代生产技术面临的问题。相比之下，第三代生产技术微生物发酵法为 VB5 生产提供了一种成本效益高且可持续的替代方案。
2025年8月，学院柳志强教授课题组在Green Chemistry期刊上发表题为 《Enhancing vitamin B5 biosynthesis by multimodule optimization and protein engineering》的研究论文，本研究通过采用代谢工程技术将多模式途径增强（包括R-泛解酸、丙酮酸、一碳单位和β-丙氨酸模块）与AHAIR蛋白工程相结合，最终开发出优化菌株DPAC4。该工程菌株实现了148.31 g/L 的滴度，生产率为 1.54 g/L/h，是迄今为止报道的最高 VB5 生产水平。为了解决补充β-丙氨酸的经济问题，进一步开发了FBRV（Fully biosynthetic route for VB5）策略，在不需要外源添加β-丙氨酸的发酵条件下实现了65.12 g/L的VB5产量。这一新路线的开发极大地提升了未来VB5第三代微生物发酵技术的产业化生产可行性，这一成果是项目组即2019年首次报道VB5在大肠杆菌中的全生物合成后，在VB5第三代生产技术上的又一突破。课题组张博教授为论文第一作者，柳志强教授为论文通讯作者。项目得到了国家重点研发计划（2024YFA0917900）的支持。
CRISPRi引导的代谢工程增强R-泛解酸通量
为了优化碳流向R-泛解酸模块，研究团队在基础菌株DPAL6中应用了CRISPRi技术，筛选了129个候选基因，最终确定了11个对VB5生产有显著影响的关键基因（图1B）。代谢物分析表明，通过重定向TCA循环的碳流和增强一碳代谢，可以有效提高R-泛解酸的通量。
图1 基于CRISPRi技术筛选的基因作的R-pantoate模块的增强
在DPAL6菌株中过表达EcilvD、BspanB*、CgpanC和BsalsS等基因后，VB5产量显著提升，但panE的过表达却导致产量下降至1.3 g/L（图1C）。进一步测试不同来源的panE同源基因（如EcpanE、BspanE等）后，发现VB5合成均受到抑制。研究推测，PanE的逆反应（将2-酮基泛解酸（2-KPA）转化回上游中间体）以及2-KPA的供应不足是导致这一现象的原因。外源添加2-KPA（1 g/L）后，VB5产量得到恢复（图1D），但残留的2-KPA积累表明其合成和下游利用仍存在瓶颈（图1E）。
为进一步提升通量，研究团队在DPAL6中逐步过表达ilvD、BspanB*、CgpanC和BsalsS，构建了DPAZ2-DPAZ6菌株（图1F）。结果显示，DPAZ6菌株减少了副产物（如甲酸、乙酸、α-酮戊二酸等）的积累，VB5产量提高至4.51 g/L（比DPAL6增加84%）。这表明增加R-泛解酸途径相关基因的拷贝数能够有效减少碳流向有机酸和TCA循环，从而提升VB5产量。
重塑中心代谢通量以增强R-泛解酸途径
丙酮酸在细胞代谢和TCA循环中扮演核心角色，是乙酰辅酶A、L-缬氨酸等多种代谢物的前体，也是VB5生物合成的关键底物（图2A）。基于CRISPRi实验和中间代谢物分析，研究团队假设抑制TCA循环中的关键基因（如gltA和aceE）可以增强VB5生产。
重塑中心代谢通量以增强R-泛解酸途径
丙酮酸在细胞代谢和TCA循环中扮演核心角色，是乙酰辅酶A、L-缬氨酸等多种代谢物的前体，也是VB5生物合成的关键底物（图2A）。基于CRISPRi实验和中间代谢物分析，研究团队假设抑制TCA循环中的关键基因（如gltA和aceE）可以增强VB5生产。
图2 丙酮酸代谢节点和TCA修饰对VB5生物合成的影响
通过将gltA的起始密码子由ATG替换为GTG或TTG，降低了其翻译效率，VB5产量逐渐增加。菌株DPAT2（DPAZ6/gltATTG）的VB5产量达到5.14 g/L（图2B）。有机酸检测显示，TCA循环中间体α-酮戊二酸的积累减少，表明限制细菌生长并将碳流重定向至VB5生物合成是一种有效策略。
为进一步限制TCA循环活性，研究团队引入了8种柠檬酸合酶（CS）变体（图2G）。其中，M372S变体将VB5产量提升至5.51 g/L，同时减少了α-酮戊二酸的积累（图2C）。M372S突变位于底物结合区域，可能降低了酶对乙酰辅酶A的亲和力，从而减少碳流向TCA循环。
此外，研究团队针对丙酮酸脱氢酶复合体（E1亚基，由aceE编码）进行了改造。H142V变体显著提高了VB5产量至6.30 g/L（图2D），同时减少了α-酮异戊酸的积累（图2E）。该突变降低了丙酮酸的亲和力，使更多丙酮酸流向R-泛解酸合成途径。
为了进一步扩大丙酮酸库，研究人员筛选了参与丙酮酸生成的基因，如pykA和pykF，以及与丙酮酸消耗相关的基因，如ppc，accD和ppsA。通过破坏ppc和accD基因，VB5产量分别降至0.64 g/L和6.28 g/L；而减弱ppsA的表达则使DPAT5菌株的VB5产量提升至6.46 g/L（图2F）。进一步过表达pykA后，DPAT6菌株的VB5产量达到6.69 g/L。这些结果表明，减少中心代谢活性、扩大前体库并重定向碳流是提升目标产物合成的有效策略。
增强一碳单位供应
在VB5生物合成中，α-酮异戊酸转化为酮基泛酸的过程需要消耗一碳单位（图3A）。丝氨酸通过丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT，由glyA编码）作为主要的一碳单位供体，为VB5合成提供甲基（图3B）。此外，5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-MTHF）作为甲基载体，将丝氨酸途径与VB5生物合成紧密联系。
图3 增加一碳单位的供应，以增强R-泛解酸途径
研究团队首先尝试过表达glyA基因以促进丝氨酸降解，但VB5产量并未提升（图3D）。外源添加甘氨酸（0.5、0.8、1 和 1.5 g/L）后，VB5产量逐渐下降（图3E），表明甘氨酸积累对VB5合成有负面影响。为解决这一问题，研究团队替换了甘氨酸裂解系统（GCS系统）的天然启动子，并去除了gcvA和purR的转录抑制位点（图3C）。这一改造增强了GCS系统，使VB5产量提升至6.77 g/L（图3F）。叶酸作为一碳单位的载体，其供应量对VB5合成至关重要。外源添加0.1 g/L和0.2 g/L叶酸后，VB5产量分别增至6.82 g/L和7.05 g/L（图4B）。过表达folP基因后，VB5产量进一步提升至6.98 g/L（图4E）。此外，通过引入甘氨酸核糖体开关（Apt2#82，Apt2#82序列是一个调节位点，结合后会改变空间构型并覆盖核糖体结合位点），动态调控丝氨酸途径关键基因的表达，VB5产量增至7.44 g/L（图4F）。补充外源丝氨酸后，产量达到7.83 g/L。
图4 增强叶酸生物合成途径表达和引入核糖体开关结构对VB5产生的影响
AHAIR的底物特异性改造
乙酰乳酸还原异构酶（AHAIR，由ilvC编码）在R-泛解酸途径中催化2-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸，但其底物混杂性可能导致碳流向异亮氨酸途径（图5A）。研究团队通过分子对接和分子动力学模拟，筛选了多个AHAIR变体。其中，V115I变体使VB5产量增至2.79 g/L（图5F），而A47S变体则减少了异亮氨酸的积累（图5G）。双突变体V115I/A47S进一步将VB5产量提升至2.68 g/L，同时降低了异亮氨酸含量（图5G）。将V115I/A47S整合至DPAC3菌株基因组后，DPAC4菌株的VB5产量增至8.41 g/L，异亮氨酸积累显著减少。
图5 理性设计Ec-AHAIR，实现底物对（S）-2-乙酰乳酸的高特异性增加一碳单位的供应，以增强R-泛解酸途径
在5 L生物反应器中，DPAC4菌株通过补料分批发酵实现了148.31 g/L的VB5产量，生产率为1.54 g/L/h（图5H）。这一结果展示了该菌株在工业化生产中的潜力。
构建β-丙氨酸模块以实现完全生物合成路线（FBRV）
尽管DPAC4菌株在添加β-丙氨酸的条件下实现了高产，但外源β-丙氨酸的使用增加了生产成本。为此，研究团队设计了完全生物合成路线（FBRV），通过增强β-丙氨酸合成模块（TCA还原路径、TCA氧化路径、双路径），实现了不依赖外源β-丙氨酸的VB5生产（图6A-C）。先前的研究表明，双路径是生产β丙氨酸的更有利途径，因为它在减少碳流失和最高的理论产量方面取得了有效的平衡。因此，DPAS3菌株通过双路径策略，VB5产量达到4.54 g/L。在5 L发酵罐中，DPAS3菌株的VB5产量为65.12 g/L，生产率为0.93 g/L/h（图6E）。
图6 构建β-丙氨酸模块实现DPA全生物合成