近日，学院邹树平教授等在《Metabolic engineering》期刊发表题为《Heterologous integration-assisted metabolic engineering in Escherichia coli for elevated D-pantothenic acid production》的研究性论文，通过代谢工程对大肠杆菌的D-泛酸（D-PA）合成途径进行了系统改造，构建了一株性能卓越的生产菌株，将D-PA发酵产量增产至98.6 g/L。课题组博士生赵阔为第一作者，邹树平教授为通讯作者。
图1.工程化大肠杆菌生产D-泛酸的示意图。
本研究创新性地整合中心代谢重排、底物转运工程、模块化途径优化、CRISPRi 介导的瓶颈识别、辅因子平衡调控及发酵工艺优化等系统代谢工程策略，有效提升前体供应与 D-PA 的高效合成，为其由实验室开发向工业化生产转化奠定了坚实基础。
主要研究内容如下：
1.重塑中心碳代谢减少副产物形成
以团队前期构建的D-PA生产菌株DPA11为底盘，通过依次删除主要副产物生成通路来优化碳流。然而pta-ackA和zwf敲除的氧化还原和能量稳态失调，不利于菌体生长及D-PA合成。结合氨基酸代谢产物分析揭示了D-PA合成的主要限制因素，并为后续菌株改造提供了指导。
图2.中心碳代谢重编程对D-泛酸生物合成的影响。
2.优化底物利用，提高D-PA合成效率
在D-PA生产中，葡萄糖和β-丙氨酸是主要底物。为提升底物利用效率，针对PTS系统核心基因ptsG的增加拷贝，调控因子arcA敲除提高了葡萄糖消耗速率和D-PA产量，进一步整合ptsG（DPZ13）产量升至2.48 g/L。另外，增加β-丙氨酸转运蛋白CycA的表达，减少了β-丙氨酸的添加量下降20%，减少了发酵生产成本。
图3.强化葡萄糖和β-丙氨酸利用对D-泛酸生产的影响。
3.异源途径工程缓解辅酶平衡
为优化辅因子供应模块，本研究引入了Clostridium acetobutylicum来源的NADP⁺依赖型GAPDH，并结合PntAB-NadK系统，以改善胞内氧化还原平衡。同时，通过整合Acinetobacter johnsonii 来源的AMP 磷酸转移酶PAP与Cytophaga hutchinsonii 来源的多磷酸激酶PPK实现互补表达，有效协调胞内ATP水平，优化能量供应。
图4.强化NADPH和ATP供应以提高D-泛酸产量。
4.途径工程增强向D-PA生产的代谢驱动力
为途径工程增强D-PA合成途径的代谢驱动力。筛选了不同来源的途径酶并通过RBS工程优化了其表达量。结果发现中强度表达的CgKPHMT和高强度表达的CgPS组合最有利，而PaKPR低表达更有利于D-PA合成。对KIVA模块的启动子/终止子调控未提升产量，表明通路酶表达需保持平衡与协调以实现高产D-PA。
图5.通过途径工程增强向D-泛酸生产的代谢驱动力。
5.重构一碳生物合成途径
针对限速酶KPHMT依赖的5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-CH₂-THF）供应瓶颈，本研究利用CRISPR干扰（CRISPRi）筛选出影响其合成的关键酶——丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT），确认其为胞内5,10-CH₂-THF的主要供应途径。为进一步增强5,10-CH₂-THF供应并避免与中心代谢竞争，引入了Methylobacterium extorquens AM1来源的甲酸-THF连接酶（FTL）、甲酰-THF环化酶（FCH）及亚甲基-THF脱氢酶（MTDA），在大肠杆菌中成功重构了功能性的异源5,10-CH₂-THF合成通路，为提升5,10-CH₂-THF依赖的目标产物生物合成提供了有效策略。
图6.重构5,10-亚甲基四氢叶酸生物合成途径以提高大肠杆菌的D-泛酸产量。
6.动态平衡产物和细胞生长
为平衡产物和细胞生长，采用生长阶段依赖型启动子动态调控关键基因构建了菌株DPZ28。研究证实了优化TCA循环与D-PA合成的动态平衡，是提升D-PA产量的关键策略。
图7.协同动态调控在维持细胞生长的同时提高D-泛酸产量。
7.发酵工艺优化
基于在5 L发酵罐中采用20%溶氧反馈控制的馈料批发酵条件，本研究优化了残糖水平并建立双阶段调控策略。该策略通过适度提高残余葡萄糖浓度，缓解了碳源限制，显著提升了D-PA产量，凸显了精准葡萄糖调控在高效生产中的关键作用。
图8.在5升生物反应器中补料分批发酵生产D-泛酸。
该研究得到了国家重点研发计划项目(2022YFC2105400)的支持。