近日，学院孙东昌教授课题组在《Nucleic Acids Research》发表题为《A quorum sensing-controlled type I CRlSPR toolkit for dynamically regulating metabolic flux》的研究性论文，开发了一种用于动态调节代谢流的自诱导I型CRISPRi调控工具包，并将其用于枯草芽孢杆菌代谢调控，提高维生素合成效率。课题组硕士生郑涵为第一作者，孙东昌教授为通讯作者。
图1 基于QS调控的I型CRISPRi系统（QICi）的开发、优化与应用
首先，本研究开发了QICi 1.0系统，其中crRNA的表达由PhrQ-RapQ-ComA 群体感应系统（QS）调控，而Cascade复合物的表达则由组成型启动子P43UTR12控制。随后，对QS系统进行了优化以提升其性能，并简化了crRNA表达载体的构建流程。随后，进一步开发了QICi 2.0工具包，其中Cascade复合物的表达由优化后的QS系统控制，而crRNA则由组成型启动子Pveg驱动表达。最终，QICi 2.0工具包被用于通过动态重分配代谢流来提高DPA和RF的产量。
主要研究内容如下：
1. 基于QS的I型CRISPRi回路1.0（QICi 1.0）的表征与设计
首先，PsrfAA转录活性实验表明随细胞密度增加而显著增强，展现出优异的细胞密度响应灵敏度。其次，用QS系统调控靶向gfp基因的crRNA的转录，构建功能菌株PCSAQ，初步展现出细胞密度响应特性，但其调控效率较低。
图2 初始QS控制的I型CRISPRi系统（QICi 1.0）的开发
2. 通过截短重复序列对I型CRISPRi系统进行简化设计
本团队前期开发的I型CRISPRi系统中，间隔序列（spacer，32 bp）两侧配置了完全同源的重复序列（repeat，各 29 bp），这种设计在载体构建时存在非预期同源重组风险，通常需要采用两阶段构建策略。本研究优化了重复序列结构，表明当5'端截短至13 bp及3'端截短至25 bp的功能菌株PCD4S仍能维持与PCS（全长重复序列）相当的抑制效果（抑制效率>92%），更重要的是实现了crRNA表达载体的单步构建。
图3 优化crRNA表达载体的构建流程
3. 用于动态转录调控的优化型QICi 2.0回路的构建
为构建可编程的基因表达调控网络，本研究通过组合不同强度的组成型启动子 Phag（中等强度）和P43UTR12（高强度）来分别控制 RapQ和PhrQ 的表达，并开发了三套模块化QS系统（Q2-Q4）。结果表明：在培养16小时后，Q3和Q4的相对荧光强度分别达到Q1的4.94倍和6.33倍；在对数生长期（约10小时），PCSAQ系列菌株中的CRISPRi系统开始发挥功能，其中，Q3系统控制的 CRISPRi（PCSAQ3）在24小时的抑制效果能够达到1.70倍。本研究还构建了另一个动态回路，即PsrfAA驱动Cascade表达的菌株PSCAQ3，结果表明QS控制Cascade的表达比控制crRNA时更有效，抑制效果相比优化前提高了2倍。
图4 优化的QICi 2.0的开发
4. 使用QICi 2.0工具包对芽孢形成或TCA循环进行动态下调可提高DPA效价
本研究通过加强泛解酸合成途径、增加5,10-亚甲基四氢叶酸辅因子供应、减少芽孢形成等策略构建了无β-丙氨酸添加时的DPA底盘菌。在此基础上，利用QICi 2.0工具包抑制编码芽孢形成蛋白编码基因spo0A或编码柠檬酸合酶编码基因citZ的表达。其中，动态调控citZ表达使DPA摇瓶产量提升至1.55 g/L，在5 L罐分批补料发酵中，产量达14.97 g/L，充分展示了QICi在促进生物反应器中生物合成效率提升方面的潜力。
图5 利用QICi 2.0工具包动态调控芽孢形成和代谢流以促进DPA生物合成
5. 利用QICi 2.0工具包优化RF生产
本研究通过增加rib操纵子拷贝数的策略构建了产RF的工程菌。在此基础上，利用QICi分别动态抑制ribC、pfkA和purR基因表达。其中，QICi介导6-磷酸果糖激酶基因pfkA的表达使RF产量提升最为明显，提高了2.49倍，表明该工具可广泛应用于多个高附加值产品的生产。
图6 利用QICi 2.0工具包提升RF生物合成效率
该研究得到了国家自然科学基金项目（32170083和31670084）和浙江省重点研发计划项目（2020C02031）的支持。
原文链接：https://academic.oup.com/nar/article/53/14/gkaf693/8208113?searchresult=1